比濁法測定大腸桿菌
發(fā)布時間：2023-04-25 瀏覽次數(shù)：2835
大腸桿菌的測定方法有多種，如用細(xì)菌計菌器，平板菌落計數(shù)法，光電比濁計數(shù)法，薄膜計數(shù)法等。
薄膜計數(shù)法
下面介紹比濁法測定大腸桿菌的方法。
1.實驗?zāi)康?/span>
了解細(xì)菌生長曲線的持點及測定原理，學(xué)會用比濁法測定細(xì)菌的生長曲線。
2.實驗原理
將一定數(shù)量的細(xì)菌，接種于適宜的液體培養(yǎng)基中，在適溫下培養(yǎng)，定時取樣測數(shù)，以菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，生長時間為橫坐標(biāo)，作出的曲線稱為生長曲線。該曲線表明細(xì)菌在一定的環(huán)境條件下群體生長與繁殖的規(guī)律。一般分為遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期四個時期（如圖），各時期的長短同菌種本身特征、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件不同而異。
生長曲線示意圖
比濁法是根據(jù)細(xì)菌懸液細(xì)胞數(shù)與混濁度成正比，與透光度成反比關(guān)系，利用光電比色計測定細(xì)胞懸液的光密度(即OD值)，用于表示該菌在本實驗條件下的相對生長量。
實驗設(shè)正常生長、加酸抑制和加富培養(yǎng)等三種處理，以了解細(xì)菌在不同生長條件下的生長情況。
3.實驗器材
(1)活材料：大腸桿菌(E.coli)。
(2)培養(yǎng)基和試劑：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基14支(每支10mL)，濃縮5倍的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1支。無菌酸溶液(甲酸：乙酸：乳酸=3：1：1)。
(3)器材：1mL無菌吸管、搖床、冰箱、光電比色計、標(biāo)簽等。
4.實驗方法
（1）接種：取13支裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的試管，貼上標(biāo)簽(注明菌名、培養(yǎng)處理、培養(yǎng)時間、組號)。按無菌操作法用吸管向每管準(zhǔn)確加入0.2mL的大腸桿菌培養(yǎng)液，接種后，輕輕搖蕩，使菌體混勻。另一支不接種的培養(yǎng)管注明CK(對照)。
（2）培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)管置于搖床上，在37℃下振蕩培養(yǎng)。其中9支培養(yǎng)管分別于培養(yǎng)的0、1.5、3、4、6、8、10、12和14h后取山，放冰箱中貯存，待測定。加酸處理。取出經(jīng)4h培養(yǎng)的另二支培養(yǎng)管，按無菌操作法加入lmL無菌酸溶液，搖勻后放回?fù)u床上，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，于培養(yǎng)8h和14h后取出放冰箱中貯存，待測定。加富營養(yǎng)物處理。余下的二支培養(yǎng)管于培養(yǎng)6h后取出，按無菌操作法加入濃縮5倍的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液1mL，搖勻后，繼續(xù)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，于培養(yǎng)8h和14h后取出，放入冰箱中貯存，待測定。
（3）比濁：將培養(yǎng)不同時間、形成不同細(xì)胞濃度的細(xì)菌培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使光密度值在0.0-0.4范圍內(nèi)，以未接種的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基調(diào)零點，在光電比色計上，選用400-440nm波長的濾光片進(jìn)行比濁，從最稀濃度的菌懸液開始，依次測定。
將大腸桿菌接入裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的小試管中(試管要能插入放比色杯的比色槽內(nèi))。37℃下振蕩培養(yǎng)，分別在0、1.5 、3、4、6、8、10、12和14h取出，以未接種培養(yǎng)液調(diào)零點，在光電比色計上比色。比色時應(yīng)自制一個暗盒將培養(yǎng)管和比色槽罩住，以形成一個暗室。
5.繪制曲線
以細(xì)菌懸液的光密度值(OD)為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，給出大腸桿菌在正常生長、加酸處理和加富培養(yǎng)三種條件下的生長曲線。
如果我們將上述培養(yǎng)0，1.5，3，4，6，8，10，12，14h的細(xì)菌懸液用稀釋平板測數(shù)法進(jìn)行測數(shù)，測出不同時間的含菌數(shù)，以菌懸液比濁的光密度值為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌的數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制一標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣在測得了任一培養(yǎng)時間的菌懸液光密度值后，就可以在此標(biāo)淮曲線上查出含菌數(shù)。這種方法已在工業(yè)上廣泛采用，它可以節(jié)省許多稀釋平板測數(shù)的時間，直接用比濁法測得的光密度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線以了解各個培養(yǎng)時期的菌數(shù)消長情況。
來源：網(wǎng)絡(luò)
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