支原體的培養(yǎng)法檢測(cè)詳細(xì)介紹！
發(fā)布時(shí)間：2023-12-06 瀏覽次數(shù)：1719
支原體是細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的外源性污染物，對(duì)于生物制品生產(chǎn)企業(yè)來說，支原體污染是非常嚴(yán)重的問題，給生物制品帶來難以估量的安全隱患。因此，開展支原體檢查是細(xì)胞質(zhì)量控制微生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)體系中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。針對(duì)支原體對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)帶來的巨大不良影響，在中國(guó)藥典、美國(guó)藥典、歐洲藥典和日本藥典中都要求，對(duì)主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)、病毒種子批以及病毒疫苗等執(zhí)行支原體檢查。
01 目前有哪些常見的檢測(cè)方法？
常見的支原體檢測(cè)方法
培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法則是被各國(guó)藥典普遍認(rèn)可的、用于生物制藥的質(zhì)控的支原體檢測(cè)方法。然而，培養(yǎng)法所使用的培養(yǎng)基并不能適用所有的支原體生長(zhǎng)，存在一定的局限性，同樣指示細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于一些胞質(zhì)吸附能力較弱的支原體檢出也會(huì)存在一定的局限性。因此，藥典中要求對(duì)支原體檢測(cè)需要兩種方法共同檢測(cè)，以確保支原體檢出的效力。
02 直接培養(yǎng)法
《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的支原體檢測(cè)方法培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）是檢測(cè)支原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，能夠檢測(cè)不同生長(zhǎng)特性的支原體。下面我們?cè)敿?xì)介紹一下直接培養(yǎng)法。
1) 不同培養(yǎng)基
由于支原體DNA中缺少編碼中間代謝產(chǎn)物的基因, 支原體的能量代謝系統(tǒng)比較簡(jiǎn)單，因此支原體具有“營(yíng)養(yǎng)缺陷”的特點(diǎn)，許多重要代謝途徑受阻，如三羧酸循環(huán)、糖異生等。這使得支原體生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求比一般細(xì)菌要高，生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分主要從外界攝取，除需要含有碳源、氨基酸、無機(jī)鹽等基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還需加入人或動(dòng)物血清，以提供支原體生長(zhǎng)、繁殖所必需的膽固醇和脂肪酸。
● 根據(jù)支原體是分解葡萄糖還是利用精氨酸，支原體培養(yǎng)基可以分為2類，即葡萄糖發(fā)酵型和精氨酸水解型。解脲支原體雖然不能利用葡萄糖或精氨酸，但可以利用精氨酸水解生成的尿素。
● 根據(jù)培養(yǎng)基中是否有瓊脂及其含量又可分為液體、半流體與固體培養(yǎng)基。
2) 不同培養(yǎng)法
● 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法：在富含葡萄糖的支原體肉湯培養(yǎng)基中，支原體分解葡萄糖產(chǎn)生酸性物質(zhì)，從而使液體培養(yǎng)基pH值下降為酸性，顏色變黃；精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基pH值為堿性，支原體生長(zhǎng)可分解尿素，產(chǎn)生氨，會(huì)使得pH進(jìn)一步變高，培養(yǎng)基顏色變?yōu)樘壹t色，提示有支原體生長(zhǎng)；
● 半流體培養(yǎng)基培養(yǎng)法：在半流體培養(yǎng)基中如觀察到沿接種線呈煙霧狀，則提示有支原體生長(zhǎng)；
● 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法：在固體瓊脂培養(yǎng)基上，可觀察到支原體形成經(jīng)典的“油煎荷包蛋”式的菌落，通過觀察菌落形態(tài)以判斷是否存在支原體污染。
操作規(guī)范的情況下，直接培養(yǎng)法不容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，檢測(cè)精確度很高，因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。缺點(diǎn)是檢測(cè)周期太長(zhǎng)，支原體要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要28天時(shí)間，對(duì)于放行周期要求比較苛刻的生物制品如CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品，該方法會(huì)帶來實(shí)際應(yīng)用上的挑戰(zhàn)。
03 直接培養(yǎng)法的特點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)：在選用合適培養(yǎng)基以及合規(guī)要求操作下，很少會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，檢測(cè)精確度很高，因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。
缺點(diǎn)：操作時(shí)間太長(zhǎng)，至少28天才能出結(jié)果，滿足不了大多數(shù)質(zhì)檢部門的要求。無法檢測(cè)出死亡的支原體。
來源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“ 恒馭生物 ”公眾號(hào)，作者~海芋。
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