微生物種類繁多，數(shù)量龐大，但它們既微小又透明，我們根本沒法看清楚，更別說研究它們。要想觀察細菌，必須采用特殊的染色方法將微生物著色，這樣既方便觀察也便于鑒別菌種。

細菌染色法是為了便于觀察和研究而利用有關(guān)染料使細菌細胞著色的方法。細菌染色方法很多，根據(jù)不同的目的采用不同染色方法。細菌染色法作為微生物學(xué)實驗中最為基礎(chǔ)的技術(shù)，在實驗室過程中廣泛使用，所以學(xué)會細菌染色是進入微生物實驗室的第一步。

正染色是強化標(biāo)本的結(jié)構(gòu)，即染色劑與樣品結(jié)合，增強其散射電子的能力，最終在熒光屏上形成正象。

負(fù)染色是將標(biāo)本包埋在染色物質(zhì)里，借助染色劑增強背景對電子散射的作用，而標(biāo)本在熒光屏上形成暗背景下的亮，故又稱“襯托染色法”、“間接染色法”。

在負(fù)染色法中，標(biāo)本不需要熱固定，細胞不會因為化學(xué)藥物的影響而變形，對于不易染色的細菌或病毒也能觀察。

接下來，按照實驗原理、實驗步驟、注意事項以及疑難解答等幾個方面向各位小伙伴們一一進行詳細闡述。

一、簡單染色法

簡單染色法，又叫單染色法，就是使用一種染料對細菌染色的方法，是實驗室常用的一種染色技術(shù)，主要用于觀察細菌的形態(tài)和大小，但不能用于鑒別細菌。

1、實驗原理：主要基于細菌細胞在特定條件下的表面電荷性質(zhì)和染料的化學(xué)性質(zhì)。

1）在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負(fù)電荷，而常用的堿性染料（如美藍、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、沙黃、孔雀綠等）在電離時，其染色部分帶正電荷。因此，這些堿性染料的染色部分很容易與帶負(fù)電荷的細菌結(jié)合，使細菌著色。
2）利用單一染料對細菌進行染色，染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，從而更清楚地觀察到細菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

2、染液的配制

1）結(jié)晶紫液：結(jié)晶紫乙醇飽和液(結(jié)晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸銨水溶液80mL，將兩液混勻置24h后過濾即成。 
2）番紅溶液：番紅O2.5g，95%乙醇100mL，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶中，用時取20mL與80mL蒸餾水混勻即可。

3、應(yīng)用：簡單染色法操作簡便，適用于菌體的一般形態(tài)和排列的觀察。

4、實驗步驟
1）準(zhǔn)備。一般載玻片浸泡在酒精中清洗油漬，在實驗之前，用鑷子取出，在酒精燈火焰上方灼燒一下，去除酒精。
2）涂片。在潔凈的載玻片上滴加一滴無菌水，然后用無菌接種環(huán)挑取適量細菌懸浮液并涂成薄膜。
3）固定。在酒精燈上方加熱，但要注意溫度不要過高，以免破壞細菌的形態(tài)，手指輕叩微燙即可。也可以使用化學(xué)固定劑（如甲醛）來固定細菌，以確保細菌的形態(tài)不受損失。
4）染色。滴加染液覆蓋涂片，讓細菌與染液充分接觸，通常染色時間為1-3min。
5）沖洗。用洗瓶沖洗涂片，直到流出的水中無染液顏色為止。
6）干燥。將涂片自然晾干或用吸水紙輕輕吸干。
7）鏡檢。使用顯微鏡觀察細菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

5、影響因素及注意事項

1）涂片：厚度不合適，過厚或過薄都會影響觀察。涂片不均勻，染色不均勻，深淺不一，影響觀察效果。
2）固定：微熱即可，不需要太熱，菌體形態(tài)容易改變。
3）染色：染色時間的長短要靈活掌握，不能死記時間，要根據(jù)染液濃度和涂片的厚度適當(dāng)調(diào)整。到處需要積累經(jīng)驗沒辦法。
4）染色過程中勿使染色液干涸。
5）涂片須完全干燥后才能用油浸物鏡觀察。

二、革蘭氏染色法

革蘭氏染色法（Gram Staining）是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師漢斯·克里斯蒂安·革蘭(Hans Christian Gram，1853年-1938年)創(chuàng)立。

未經(jīng)染色的細菌，由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難觀察。染色后細菌與環(huán)境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，而用以分類鑒定，革蘭氏染色屬于復(fù)染法。

這種染色法利用細菌細胞壁上的生物化學(xué)性質(zhì)不同，將細菌分成兩類，即革蘭氏陽性（Gram Positive，G+）與革蘭氏陰性（Gram Negative，G-）。

1、實驗原理：通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

2、染液的配制

1）結(jié)晶紫液：同上。
2）盧戈氏碘液：碘0.33g，碘化鉀0.66g，蒸餾水100mL。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸餾水至100mL即成。配成后貯于棕色瓶內(nèi)備用，如變?yōu)辄S色即不能使用。 
3）95%乙醇：用于脫色
4）番紅溶液：同上。

3、應(yīng)用：應(yīng)用于細菌檢測，細菌的鑒別和分類，病毒的檢測以及生物樣品的特性分析。

4、實驗步驟（革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具體操作方法如下）：

1）制片：固定，操作同上；
2）初染：滴加草酸銨結(jié)晶紫染色1min，水洗；
3）媒染：滴加革蘭氏碘液（碘-碘化鉀溶液）染色1min，水洗；
4）脫色：滴加體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，約45s后水洗；
5）復(fù)染：滴加番紅染液染色3min，水洗并使之干燥；
6）鏡檢：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

5、影響因素及注意事項

1）選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細菌會被染成紅色而造成假陰性。
2）涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。
3）脫色是革蘭氏染色是否成功的關(guān)鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。
4）如用火焰固定涂片時，將涂面向上，通過火焰數(shù)次，以手接觸玻片，稍感燙手時即可。要防過熱，否則使細菌變形或影響染色反應(yīng)。

三、抗酸性染色法

抗酸性染色法（acid-fast staining method）是一種鑒別染色法，在普通微生物實驗室不太常用。該染色法1882年由埃利希（F．Ehrlich）首創(chuàng)并經(jīng)F．齊爾（Ziehl）改進而創(chuàng)造出的細菌染色法。

1、實驗原理：結(jié)核分枝桿菌對苯胺染料一般不易著色，若加溫或延長染色時間使其著色后，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，經(jīng)此染色后，結(jié)核分枝桿菌及其他分枝桿菌呈紅色，而非抗酸菌和細胞雜質(zhì)等呈藍色。

2、染液的配制：
1）石炭酸復(fù)紅液：堿性復(fù)紅4g，溶于95%酒精100mL作成飽和溶液，再取該飽和液10mL與5%石炭酸溶液90ml混勻即成。
2）3%鹽酸酒精液：濃鹽酸3mL加入95%酒精97mL中即成。
3）呂(Loeffer)氏美藍染色液：美藍2g，溶于95%酒精100mL中，作成飽和液。再取該飽和液30mL與0.01%氫氧化鉀水溶液100mL混合均勻即可。

3、應(yīng)用：主要用于結(jié)核分枝桿菌和奴卡菌的染色鑒定。

4、實驗步驟：
1）涂片：取菌懸液，在清潔無油脂載玻片上涂開，涂抹區(qū)約拇指蓋大。
2）固定：涂片自然干燥后，用片夾挾住玻片一端，通過火焰固定。
3）染色：涂抹面用濾紙片蓋上，然后往濾紙片上滴加石炭酸復(fù)紅染液，使濾紙片完全被染液浸濕，持載玻片在小火上加溫片刻然后離開火焰，此時可見到玻片上冒出蒸氣。待蒸氣消失后再加溫，如此反復(fù)3~4次，約5min，加溫時隨時添加染液勿使紙片干涸。
4）沖洗：玻片冷卻后，用接種環(huán)挑去濾紙扔到污物盆內(nèi)，流水沖洗玻片。
5）脫色：滴加3%鹽酸酒精脫色，至涂抹均勻部位基本沒有紅色再脫下為止，水洗。
6）染色：滴加呂氏美藍染液30s，水洗，干燥。
7）鏡檢。

5、注意事項
1）生物樣品在使用時禁止直接接觸，避免感染。
2）使用完需要滅菌處理并且放置到指定位置統(tǒng)一處理。

四、芽孢染色法

1、實驗原理：芽孢染色法是利用細菌的芽孢和菌體對染料的親合力不同的原理，用不同染料進行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。

1）芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當(dāng)先用一弱堿性染料，如孔雀綠或堿性品紅在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。
2）芽胞具有高度的折光性，外膜致密，滲透性低，故普通染色法不易使其著色，芽胞染色法是根據(jù)芽胞既難以著色，而一旦著色又難以脫色的特點設(shè)計的。所有芽胞染色法都基于同一個原則：采用著色力強的染料，并加熱以促進標(biāo)本著色，然后使菌體脫色，而芽胞上的染料仍保留，經(jīng)復(fù)染后，菌體和芽胞呈現(xiàn)不同的顏色。

2、染液的配制
1）5%孔雀綠水溶液：孔雀綠5.0g，蒸餾水100mL。
2）0.5%番紅溶液：番紅O(safranine，又稱沙黃O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶中，用時取20mL與80mL蒸餾水混勻即可。

3、應(yīng)用：芽孢染色法是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常用的實驗技術(shù)，用于觀察和研究細胞的結(jié)構(gòu)和功能。芽孢的大小、形狀及其在菌體內(nèi)的位置是鑒別細菌的重要依據(jù)。

4、實驗步驟：
1）制片：常規(guī)方法涂片、干燥、固定。
2）浸染：將固定好的涂片放入含5%孔雀綠水溶液的50℃水浴染色缸中，浸染15min。
3）沖洗：取出載玻片，用水沖洗多余染液，直至出水無色為止。
4）復(fù)染：0.5%堿性番紅復(fù)染1min。
5）沖洗：用水沖洗多余染液，直至出水無色為止，干燥。
6）鏡檢。

5、注意事項
1）選用適當(dāng)菌齡的菌種，幼齡菌尚未形成芽孢，而老齡菌芽孢囊已經(jīng)破裂。
2）加熱染色時必須維持在染液冒蒸汽的狀態(tài)，加熱沸騰會導(dǎo)致菌體或芽孢囊破裂，加熱不夠則芽孢難以著色。

五、莢膜染色法

莢膜染色法是一種典型的負(fù)染色法。

1、實驗原理
1）莢膜是由細胞壁分泌并聚積在細菌細胞壁表面的一層松散的黏液物質(zhì)，沒有明顯的邊緣，其成分因不同菌種而異，主要是葡萄糖與葡糖醛酸組成的聚合物，有的也含有多肽與脂質(zhì)。
2）莢膜作為細胞外碳源和能源性儲藏物質(zhì)，能保護細胞免受干燥的影響，同時能增加某些病原菌的致病能力，抵御宿主吞噬細胞的吞噬。由于莢膜的化學(xué)成分對染液結(jié)合力很弱，不易著色。但莢膜的滲透性比較好，通?？刹捎靡r托法將染料透過菌膜，使菌體和背景著色，而莢膜不著色，這樣莢膜從菌體周圍襯托出來，呈現(xiàn)透明圈。
3）莢膜含水量在90%以上，因此，制片時一般自然干燥或置于30-40度的培養(yǎng)箱烘干固定，以免莢膜皺縮變形。 

2、染液的配制

齊氏苯酚復(fù)紅染色液：
A液：稱取0.3g堿性復(fù)紅，95%乙醇，在研缽中研磨后，分批加入95%乙醇中，繼續(xù)研磨使其溶解，配制成A液。
B液：稱取5克苯酚，溶解在95mL蒸餾水中，配制成B液。混合A液和B液即可。根據(jù)染色需要稀釋5-10倍使用，但稀釋液不易多配，以免變質(zhì)失效。

3、應(yīng)用：用于菌體莢膜的染色。

4、實驗步驟
1）涂片：取一干凈載玻片，滴加一滴蒸餾水于載玻片中央，將接種環(huán)在酒精燈火焰上充分灼燒，冷卻后挑取少量褐色區(qū)域濕潤而黏稠的菌落于蒸餾水滴中，充分把菌分散開（一般2-3min才能分散均勻）。
2）干燥：將涂片自然干燥或30-40度的培養(yǎng)箱烘干固定。
3）染色：干燥后在涂面上滴加適量齊氏苯酚復(fù)紅染液，染色3-5min。
4）水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭（或洗瓶）下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。
5）背景涂黑色素：從載玻片一端滴加1-2滴苯胺黑或碳素墨水，輕輕晃動載玻片，使苯胺黑均勻分布于載玻片上。將載玻片上的苯胺黑對準(zhǔn)日光燈，用吸水紙把多余的錛胺黑吸掉，讓光線能夠透過即可。
6）干燥：將載玻片自然干燥或30-40度的培養(yǎng)箱烘干。
7）鏡檢：用高倍鏡和油鏡觀察細菌莢膜形態(tài)。

5、注意事項
1）固定和染色過程中不能加熱，自然晾干或30-40度的干燥箱內(nèi)烘干。
2）苯胺黑背景盡可能均勻，以免影響觀察。

六、亞甲基藍染色

亞甲基藍染色是一種常見的細胞和組織染色方法，通過染色劑亞甲基藍將細胞核和細胞質(zhì)染色，幫助研究人員觀察細胞結(jié)構(gòu)和功能。

1、實驗原理
1）利用染色劑亞甲基藍與DNA或RNA結(jié)合后呈現(xiàn)不同的顏色，從而觀察細胞核和細胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。
2）亞甲基藍是一種帶正電荷的堿性染料，可以與DNA和RNA的負(fù)電荷結(jié)合形成亞甲藍-DNA或亞甲基藍-RNA復(fù)合物。當(dāng)亞甲基藍與DNA或RNA結(jié)合時，會吸收特定波長的光線并反射出不同的顏色。DNA和RNA與亞甲基藍結(jié)合的程度不同，因此呈現(xiàn)出顏色的深淺也不同，這使得亞甲基藍染色成為了觀察細胞核結(jié)構(gòu)及其他親核物質(zhì)定量分析的一種有效方法。

2、染液的配制：54mL95%乙醇與40mL四氯乙烷混合搖勻后，于65攝氏度水浴3min，取出后加0.6g亞甲基藍，混勻后冷卻至4℃，加6mL冰乙酸，混勻后砂芯漏斗過濾，常溫保存。

3、應(yīng)用
1）細胞染色：亞甲基藍染色法可以用于觀察細胞形態(tài)、細胞核的大小和形狀等細胞特征。
2）染色體分析：通過亞甲基藍染色法可以觀察和分析染色體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和缺陷等。
3）核酸染色：亞甲基藍染色法可以用于檢測DNA和RNA的存在和定量。
4）細胞增殖分析：亞甲基藍染色法可以用于觀察細胞增殖和細胞周期。
5）細胞毒性分析：通過亞甲基藍染色法可以評估藥物或化合物對細胞的毒性。

4、實驗步驟
1）固定：將待染細胞或組織用4%的多聚甲醛或其他適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭?，一般固定時間為1-3分鐘。
2）染色：將固定的細胞或組織連續(xù)浸入亞甲基藍染色液中，染色時間一般為2-3分鐘。染色液的配制可以根據(jù)實驗需要進行調(diào)整。
3）沖洗：用去離子水或緩沖液輕輕洗滌染色的細胞或組織。洗滌時間根據(jù)需要可重復(fù)進行。
4）干燥：將載玻片自然干燥。
5）鏡檢：用高倍鏡和油鏡觀察細菌形態(tài)。

5、注意事項
1）固定液的選擇和濃度要適當(dāng)，過濃或過稀都會影響染色效果。
2）染色液的濃度和染色時間要控制好，過濃或過淺都會導(dǎo)致染色不均勻。
3）洗滌過程要輕柔，避免造成細胞或組織的破壞。
4）染色后要及時觀察和記錄結(jié)果，避免染色體顏色褪色或變化。

6、為什么說亞甲基藍染色是活菌染色？
亞甲藍染色法是一種常用的細菌染色方法，它可以使細菌的染色體染上藍色，同時可以區(qū)分細菌活菌與死菌。
在染色結(jié)果中，活菌的染色體呈現(xiàn)出深藍色，而死菌則呈現(xiàn)出淺藍色或無色。這是因為亞甲藍對細胞膜和染色體的親和力較弱，只有在活菌中才能充分滲透并染色。而死菌細胞膜已經(jīng)破裂，亞甲藍無法滲透到細胞內(nèi)部染色體上。

文章來源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“ 微生物知識庫”公眾號；原標(biāo)題：“細菌染色方法，超詳細實驗指南”；作者~發(fā)酵菌人。
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