在食品安全領域，病毒污染一直是全球關注的焦點。諾如病毒，作為一種極具傳染性的病原體，是導致全球約18%腹瀉病例的主要原因之一。它具有低感染劑量、快速發(fā)作和強大的傳播能力，給公共衛(wèi)生帶來了巨大挑戰(zhàn)。然而，傳統(tǒng)的檢測方法依賴于昂貴的設備和復雜的操作流程，難以滿足快速、現(xiàn)場檢測的需求。最近，一項結合了CRISPR技術與逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）的創(chuàng)新檢測方法，為這一難題帶來了新的解決方案。
諾如病毒：食品安全的重大威脅
諾如病毒是一種單股正鏈RNA病毒，屬于杯狀病毒科。其基因組包含三個開放閱讀框（ORFs），其中ORF1編碼六種非結構蛋白，ORF2和ORF3分別編碼兩種結構蛋白VP1和VP2。該病毒在全球范圍內廣泛分布，尤其在醫(yī)院、學校和郵輪等人員密集場所，一旦暴發(fā)，極易引發(fā)大規(guī)模感染。據(jù)統(tǒng)計，僅在美國，每年就有約2100萬人感染諾如病毒，其中超過70000人需要住院治療，超過800人死亡。在中國，諾如病毒也是導致食源性疾病的重要因素之一，給社會經濟帶來了沉重負擔。
傳統(tǒng)檢測方法的局限性
目前，檢測諾如病毒的方法主要包括免疫學檢測、核酸擴增技術（如PCR和qPCR）以及基因測序等。然而，這些方法存在一些局限性。免疫學方法操作相對簡單，但特異性差，對病毒變異適應性弱，靈敏度低，易產生假陽性和假陰性結果。qPCR雖靈敏度高，但設備昂貴、操作復雜，對溫度控制要求高，檢測時間長，難以在基層和現(xiàn)場應用。此外，這些方法對食品基質干擾敏感，成本較高，難以滿足現(xiàn)場快速檢測需求。這些局限性限制了傳統(tǒng)方法在實際應用中的廣泛推廣，特別是在資源有限的地區(qū)。
CRISPR/Cas12技術：為病毒檢測帶來新曙光
CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復序列）技術近年來在生物醫(yī)學領域取得了重大突破，其在分子診斷中的應用尤其引人注目。CRISPR/Cas系統(tǒng)由引導RNA（gRNA）、CRISPR相關蛋白（Cas蛋白）和目標序列組成，當gRNA與目標序列匹配時，會激活Cas蛋白的切割活性，進而產生可檢測的信號。這種技術具有高度的特異性和靈敏度，能夠精準識別目標核酸序列，為病毒檢測提供了新的思路和方法。
在這項研究中，研究人員將逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）技術與CRISPR/Cas12技術相結合，開發(fā)出一種快速、靈敏的諾如病毒檢測方法。RT-LAMP技術能夠在較短時間內完成核酸擴增，而CRISPR/Cas12技術則進一步提高了檢測的特異性和靈敏度。這種組合方法不僅操作簡便，而且對設備要求低，適合在基層檢測機構和現(xiàn)場快速檢測中應用。
圖1 逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）/ CRISPR/Cas12a 方法檢測諾如病毒（NOV）的示意圖。
檢測方法的優(yōu)勢與創(chuàng)新
研究人員開發(fā)的RT-LAMP/CRISPR Cas12a檢測系統(tǒng)具有多項顯著優(yōu)勢。首先，該系統(tǒng)僅需兩個反應溫度，整個檢測過程可在60分鐘內完成，大大縮短了檢測時間。其次，該方法對不同食品基質的干擾具有較強的抵抗力，能夠準確檢測出被諾如病毒污染的食品樣本。此外，該檢測系統(tǒng)還具有較高的靈敏度和特異性，對于諾如病毒GI和GII的檢測靈敏度分別達到32.8拷貝/反應和22.8拷貝/反應。這意味著即使在病毒含量較低的情況下，也能夠及時發(fā)現(xiàn)污染，從而有效防止病毒的進一步傳播。
圖2 逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）/CRISPR/Cas12a 的特異性和靈敏度。所有數(shù)值均為平均值 ± 標準差（SD），重復次數(shù)(n=6)。（a）諾如病毒（NOV）GI 型的檢測范圍；（b）NOV GII 型的檢測范圍；（c）NOV GI 型的特異性；（d）NOV GII 型的特異性。Fl 為熒光。
實驗驗證與應用前景
為了驗證該檢測方法的有效性，研究人員進行了大量實驗。他們選擇了三種不同的食品樣本：生蔬菜、胡蘿卜和蛤蜊，并人為添加了已知濃度的諾如病毒RNA。實驗結果表明，RT-LAMP/CRISPR Cas12a系統(tǒng)能夠準確檢測出所有陽性樣本，且未在未污染的對照樣本中檢測到信號。這表明該方法具有較高的穩(wěn)定性和可靠性，能夠滿足實際檢測需求。
此外，該檢測系統(tǒng)還具有一定的通用性，通過簡單更換引物和gRNA，可以針對其他核酸目標進行檢測。這意味著該技術不僅可以用于諾如病毒的檢測，還可以擴展到其他食源性病毒的檢測，為食品安全檢測提供了一個強大的工具。
圖3 逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）/ CRISPR/Cas12a 檢測人工污染食品樣本的結果。頂部為逆轉錄定量實時 PCR（RT-qPCR）的 Ct 值，熱圖顯示熒光強度，底部為人工 RNA 靶標的數(shù)量。（a）為諾如病毒（NOV）GI 型的檢測結果，（b）為 NOV GII 型的檢測結果。
未來展望
這項研究的成功不僅為諾如病毒的快速檢測提供了一種新的技術手段，也為其他食源性病毒的檢測開辟了新的思路。通過簡單地更換引物和crRNA，該檢測平臺可以輕松擴展到其他病毒的檢測，具有很強的通用性和靈活性。此外，該方法還可以與小型化、便攜式的檢測設備結合，進一步提高其在資源有限地區(qū)的應用價值。
參考文獻：Gou S, Liu Y, Li Q, et al. CRISPR/Cas12‐mediated detection of GI and GII Norovirus in different food samples[J]. Journal of Food Science, 2025, 90(3): e70160.
來源：微生物安全與健康網，作者~蔡偉程。
