細胞在冷解凍過程中常見問題及細節(jié)揭秘
發(fā)布時間：2022-07-08 瀏覽次數(shù)：2016
細胞回收率除了與解凍細胞過程有關(guān)，也與冷凍過程以及使用之抗凍液有很大的關(guān)系。細胞在冷凍過程中會遭受許多壓力，包含滲透壓、自由基、休眠代謝等，導(dǎo)致多數(shù)細胞在冷凍或解凍過程中死亡，敏感的干細胞更是難以存活。除了這些壓力之外，在操作過程中的細節(jié)亦可能成為回收率不佳的殺手。在冷凍及解凍的過程中應(yīng)該注意哪些細節(jié)來增加細胞的存活率呢?
1. 解凍細胞時，為什么細胞的存活率都不好?
解凍細胞時要掌握快速解凍的訣竅，而凍細胞時則要掌握緩慢凍結(jié)細胞之訣竅。解凍細胞要快是因為要防止冰晶再形成而傷害細胞。存活率不好要先確定解凍細胞時之流程是否快狠準(zhǔn)，再來凍細胞溶液中的 DMSO 會傷害細胞，若一開始沒有離心去除，最好在解凍細胞完后 8-12 小時(若為貼附細胞，要先確定細胞已貼盤)再次更換新鮮培養(yǎng)液。除此之外也有可能是凍細胞時操作不當(dāng)造成細胞在凍細胞時就已死亡。
2. 解凍細胞存活率不好，若是凍細胞時的問題?
凍細胞前要先確定細胞處在生長旺盛的 log phase，且需先檢測細胞是否還保持其性質(zhì)，例如，是否還有抗體或蛋白質(zhì)產(chǎn)生，凍細胞時的細胞濃度要在 1~5 x 10^6。再來是抗凍液之比例，DMSO約為 5-10%，其他種抗凍液則依照說明書使用?？箖鲆褐饕猛臼?strong>放慢冰晶產(chǎn)生之速度，避免冰晶刺破細胞膜，傷害細胞。凍細胞時需緩慢降溫也是要避免冰晶快速產(chǎn)生造成細胞傷害，而在 4 度到-20 度這個過程建議不要超過 1 小時，以防止冰晶過大，傷害細胞。
3. 為什么使用 Trypsin 有些細胞很快就下來，有些無法打下來?
每株細胞特性皆不相同，無法使用單一 protocol 處理。第一次使用 trypsin 時，最好觀察此株細胞對 trypsin 的耐受程度，若細胞很快就被切斷 ECM 鍵結(jié)，則之后加入 Trypsin 后可在室溫作用，避免在 37 度中作用對細胞造成傷害。若細胞打不下來，則可以放置 37 度作用約 5 分鐘，不要放太久，避免傷害細胞。除此之外要注意的是，在加入 trypsin 之前是否有使用不含鈣鎂離子的 PBS 或DPBS 將舊的培養(yǎng)液清洗干凈，因舊的培養(yǎng)液中會中和 Trypsin 之作用，鈣鎂離子也會與 Trypsin 結(jié)合，造成 Trypsin 無法作用。
細胞培養(yǎng)真的是一個非常注重細節(jié)的實驗，每一個小細節(jié)都有可能對細胞造成不可抹滅的影響，且不同細胞株有不同特性，需要注意的細節(jié)會不太一樣，除了自己尋找文獻了解細胞特性外，也可以依賴實驗室學(xué)長姊的經(jīng)驗分享及傳承喔！
