細(xì)胞傳代方法和注意事項(xiàng)
發(fā)布時(shí)間：2023-03-28 瀏覽次數(shù)：4363
傳代培養(yǎng)幾乎是所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)到一定密度都會(huì)因?yàn)榻佑|抑制而停止生長(zhǎng)，之后就需要將其稀釋分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)。這一過(guò)程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)所需，但培養(yǎng)皿中的細(xì)胞很容易受到外界污染，所有操作要在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行。
今天為大家分享細(xì)胞傳代（以HEK-293T細(xì)胞傳代為例）的方法和注意事項(xiàng)。
實(shí)驗(yàn)器材
材料：培養(yǎng)瓶/皿，離心管，移液管，移液器，廢液缸，75%酒精，所需培養(yǎng)細(xì)胞。
藥品：DMEM培養(yǎng)基，小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS緩沖液，青鏈霉素雙抗。
儀器：CO?培養(yǎng)箱，顯微鏡，超凈臺(tái)。
實(shí)驗(yàn)步驟
以HEK-293T細(xì)胞傳代為例
1. 從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，并判斷是否達(dá)到了可傳代的密度；
2. 回到超凈臺(tái)中，吸去培養(yǎng)基，加入2ml左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤(rùn)洗細(xì)胞，吸去PBS，加入0.25%胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之浸潤(rùn)所有細(xì)胞；
3. 放入37℃培養(yǎng)箱，開始消化并計(jì)時(shí)，消化時(shí)間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同，例如HEK-293T細(xì)胞消化時(shí)間為2min；
4. 用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止，通過(guò)反復(fù)吹打使細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底部，盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液（可以在顯微鏡下觀察）；
5. 收集細(xì)胞懸液離心，室溫下1200rpm，5min（不同細(xì)胞離心參數(shù)設(shè)置不同），離心完吸出上清丟棄（此時(shí)可以看到細(xì)胞在管底形成肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞團(tuán)塊，團(tuán)塊大小與細(xì)胞多少有關(guān)，拿取過(guò)程中小心不要發(fā)生碰撞）；
6. 在新的培養(yǎng)皿種加入新鮮培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，吹打幾下混勻細(xì)胞，將細(xì)胞接種到新培養(yǎng)皿，搖晃混勻；
7. 將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱。
注意事項(xiàng)
1. 無(wú)菌操作規(guī)范：在實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束后，需要將超凈臺(tái)紫外照射滅菌30min，要穿好滅菌服，戴好滅菌手套和口罩。
2. 所有物品從外面移入超凈臺(tái)都需要噴灑75%酒精消毒，并且同樣用75%酒精消毒雙手。
3. 使用胰酶消化細(xì)胞要把握好時(shí)間，切勿消化過(guò)度，及時(shí)終止消化。如果消化不夠充分可以輕拍培養(yǎng)皿幫助細(xì)胞脫落。
4. 棄上清的動(dòng)作需一次完成，切忌抬起管口，讓液體流回底部后，又再次傾倒。回流的液體會(huì)把細(xì)胞團(tuán)塊沖散甚至沖起來(lái)，再傾倒有把細(xì)胞團(tuán)塊倒掉的風(fēng)險(xiǎn)。
5. 養(yǎng)成在培養(yǎng)皿上做標(biāo)記的習(xí)慣，注明傳代時(shí)間，細(xì)胞種類。
來(lái)源：“Bioqure”公眾號(hào)
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