一種實(shí)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)過(guò)敏原快速檢測(cè)的直接快速qPCR
發(fā)布時(shí)間：2024-09-02 瀏覽次數(shù)：488
識(shí)別肉類(lèi)和食品中的動(dòng)物物種對(duì)于維持食品安全和質(zhì)量非常重要，特別是對(duì)于沒(méi)有或不正確標(biāo)記的動(dòng)物物種，可能導(dǎo)致食物過(guò)敏反應(yīng)，甚至危及生命。嚴(yán)格避免含有過(guò)敏原的食物是最有效的方法。
食品中魚(yú)類(lèi)過(guò)敏原的快速檢測(cè)對(duì)食品安全至關(guān)重要，為了確保食品中魚(yú)源成分的真實(shí)性，人們開(kāi)發(fā)了多種檢測(cè)魚(yú)類(lèi)的方法，包括顯微鏡觀(guān)察、免疫學(xué)方法、紅外光譜和色譜分析。鏡觀(guān)察有一個(gè)低檢測(cè)限，并取決于檢查員的經(jīng)驗(yàn)和肉組織的完整性。疫方法靈敏、簡(jiǎn)便，但在食品加工過(guò)程中，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)很容易被破壞，從而影響檢測(cè)。紅外光譜技術(shù)對(duì)不同的食物種類(lèi)需要不同的模型，需要大量的工作，且有一定的局限性。色譜分析根據(jù)產(chǎn)物中蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸的種類(lèi)來(lái)源，可以檢測(cè)到不同的種類(lèi)，由于產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量變化范圍廣，干擾因素多，色譜分析靈敏度低，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。與其他檢測(cè)技術(shù)相比，基于DNA檢測(cè)的PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、不受食品種類(lèi)限制等優(yōu)點(diǎn)，已成為食品中物種檢測(cè)的主流技術(shù)。然而之前的檢測(cè)方法存在一些挑戰(zhàn)，如樣品提取繁瑣、耗時(shí)。鑒于現(xiàn)有方法的局限性，作者提出了一種新的直接快速qPCR技術(shù)，以便快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的魚(yú)類(lèi)過(guò)敏原。
本文作者對(duì)魚(yú)類(lèi)物種及其對(duì)應(yīng)的Genbank編號(hào)進(jìn)行分析?；谡婧?8S rDNA基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針。使用NCBI BLAST工具評(píng)估引物和探針序列的特異性。優(yōu)化qPCR條件，建立反應(yīng)體系。分析來(lái)自不同物種樣本的特異性和添加不同濃度魚(yú)類(lèi)到其他肉類(lèi)混合物的敏感性。在真實(shí)食品樣本中進(jìn)行精密度測(cè)試。采用優(yōu)化的核酸釋放劑提取新鮮魚(yú)、蝦、牛肉、蟹、羊肉、豬肉、狗、鵝、雞和鴨的總DNA，并進(jìn)行快速定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，只有魚(yú)類(lèi)樣品呈現(xiàn)典型的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)，而其他動(dòng)物源性物種和空白對(duì)照(ddH2O)均為陰性(圖1)，說(shuō)明直接快速qPCR對(duì)魚(yú)類(lèi)具有特異性，不會(huì)與其他被測(cè)動(dòng)物物種發(fā)生交叉反應(yīng)。
確定快速qPCR條件，包括使用10μL的多探針qPCR混合物、特定濃度的引物和探針、模板DNA和循環(huán)的反應(yīng)程序。通過(guò)不同比例添加魚(yú)類(lèi)到肉類(lèi)混合物來(lái)評(píng)估敏感性。分析含魚(yú)的實(shí)際食品樣本進(jìn)行精密度測(cè)試。通過(guò)與傳統(tǒng)核酸提取方法相比較，驗(yàn)證肉類(lèi)DNA提取的核酸釋放劑的有效性。
優(yōu)化的直接快速qPCR條件包括62℃的退火溫度和0.25μM的探針濃度。直接快速qPCR具有檢測(cè)0.00001%魚(yú)類(lèi)成分的高精確度。在真實(shí)食品樣本中，中度陽(yáng)性和弱陽(yáng)性樣本的直接快速qPCR方法展示了低于2%的CV值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示直接快速qPCR方法對(duì)于檢測(cè)食品樣本中的魚(yú)類(lèi)成分具有高精確度，所有含有魚(yú)的商業(yè)樣本均呈陽(yáng)性。
本實(shí)驗(yàn)在qPCR中采用了UNG酶抗污染方案，從根本上消除了PCR擴(kuò)增子導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果，保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在操作步驟和報(bào)告等待時(shí)間方面，本研究與先前報(bào)道的魚(yú)源成分qPCR檢測(cè)技術(shù)相比具有顯著優(yōu)勢(shì)(圖2)。作為一種新型的快速現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)方法，在食品中魚(yú)類(lèi)過(guò)敏原的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖1
直接快速qPCR檢測(cè)特異性。藍(lán)色s型擴(kuò)增曲線(xiàn)為魚(yú)的檢測(cè)結(jié)果，藍(lán)色直線(xiàn)為蝦、牛肉、螃蟹、羊肉、豬肉、狗、鵝、雞、鴨及陰性對(duì)照的陰性結(jié)果。黃色s型曲線(xiàn)為內(nèi)參基因的擴(kuò)增結(jié)果。
圖2直接快速qPCR的靈敏度。
來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~魏文杰
